植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)組成及操作步驟

　　實驗原理

　　本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)水平。 用純化的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包 被單抗的微孔中依次加入植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)，再與 HRP 標記的 1,5- 二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗 滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終 的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)呈正相關。用酶 標儀在 450nm 波長下測定吸光度(OD 值)，通過標準曲線計算樣品中植物 1,5-二磷酸核酮 糖羧化酶(RubisCO)濃度。

　　試劑盒組成:

　　1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶

　　7 終止液 6ml×1 瓶 2 酶標試劑 6ml×1 瓶

　　8 標準品(300ng/L) 0.5ml×1 瓶 3 酶標包被板 12 孔×8 條

　　9 標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶 4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶

　　10 說明書 1 份 5 顯色劑 A 液 6ml×1 瓶

　　11 封板膜 2 張 6 顯色劑 B 液 6ml×1/瓶

　　12 密封袋 1 個

　　植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)組成及操作步驟 標本要求

　　1.標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能 馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

　　2.不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

　　操作步驟

　　1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀 釋。

　　150ng/L

　　5 號標準品

　　150μl 的原倍標準品加入 150μl 標準品稀釋液

　　75ng/L

　　4 號標準品

　　150μl 的 5 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液

　　37.5ng/L

　　3 號標準品

　　150μl 的 4 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液

　　18.75 ng/L

　　2 號標準品

　　150μl 的 3 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液

　　9.375 ng/L

　　1 號標準品

　　150μl 的 2 號標準品加入 150μl 標準品稀釋液2. 加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準孔、 待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl， 然后再加待測樣品 10μl(樣品最終稀釋度為 5 倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡 量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

　　3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

　　4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用

　　5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復 5 次，拍干。

　　6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。

　　7. 溫育：操作同 3。

　　8. 洗滌：操作同 5。

　　9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

　　10 分鐘.

　　10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。

　　11. 測定：以空白孔調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。 測定應在加終止 液后 15 分鐘以內進行。